液相色譜法測定疣克酊中鬼臼毒素的含量

摘要：目的：建立疣克酊中鬼臼毒素含量的液相色譜測定方法。方法：以Discovery C18（4.6×250mm，5μm）為分析柱，以甲醇-水（50∶50，V/V）為流動(dòng)相，檢測波長285nm，流速為0.8 mL·min -1。結(jié)果：當(dāng)鬼臼毒素的濃度在24.8~99.2μg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，面積與濃度間呈良好的線性關(guān)系（r= 0.9999，n=6），方法的平均回收率為98.51%，日內(nèi)和日間精密度分別為3.8%和4.1%。三批疣克酊劑中鬼臼毒素的百分含量分別為102.00%，101.46% 和100.39%。結(jié)論：本方法具有準(zhǔn)確簡便，靈敏且重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可適用于復(fù)方制劑中鬼臼毒素含量的測定。

關(guān)鍵詞：鬼臼毒素；含量測定；液相色譜法

Determination of Podophyllotoxin in YOUKEJING tincture by HPLC

ZHANG Yan，CHENG Jianfeng，HE Jianrong

（Department of Pharmacy, Tangdu Hospital, Fourth military medical university, Xi’an Shanxi 710038）

Abstract Objective: To establish HPLC method for the determination of podophyllotoxin in YOUKEDING tincture. Methods: The Discovery C18（4.6×150mm，5μm）was used as analysis column. The phase was methanol-water（50∶50，V/V）. Detection wavelength was 285 nm. The flow rate was 0.8 mL·min-1 . Results: The calibration curves was linear in the concentration range of 24.8~99.2μg·mL-1（r=0.9999,n=6）. The average recovery was 98.51%（RSD=0.48%）.The contents of podophyllotoxin in YOUKEDING tincture were 102.00%，101.46%，100.39% respectively. Conclusion: The method is simple，accurate， sensitive and good reproducible. It is suitable for the determination of podophyllotoxin and its preparations.

Key word podophyllotoxin, content determination, HPLC

  疣克酊劑是以鬼臼植物中提取的鬼臼毒素為主配制的復(fù)方酊劑，其主要成分為鬼臼毒素和阿司匹林等，通過近年來的臨床應(yīng)用，該制劑在治療尖銳濕疣及扁平疣等方面取得了良好的效果，臨床療效觀察表明，復(fù)方制劑中鬼臼毒素的濃度過高，易引起皮膚的淺表糜爛、局部水腫及劇烈疼痛，而濃度過低則療效較差，準(zhǔn)確的控制好復(fù)方制劑中鬼臼毒素的濃度有著重要的意義。目前，藥材中鬼臼毒素含量測定已有變色酸法[1]、羥胺-三氯化鐵法[2]、薄層掃描等方法被報(bào)道[3-5]，但疣克酊為復(fù)方制劑，內(nèi)源性物質(zhì)的干擾較強(qiáng)，上述方法不能用于復(fù)方制劑中鬼臼毒素的定量分析，對(duì)此，本文建立以RP-HPLC測定疣克酊劑中鬼臼毒素含量的方法，試用結(jié)果表明，本方法具有準(zhǔn)確度高，專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于鬼臼毒素及其制劑分析。

1.儀器與試藥

1.1 儀器：日本Shimadzu LC-10AVP液相色譜系統(tǒng)，含兩臺(tái)LC-10Atvp型泵，7725型進(jìn)樣閥（配100μL定量環(huán)），SPD-M10Avp二極管陣列紫外可見檢測器，CTO-10Asvp柱箱，Class-vp5.0色譜工作站。Discovery C18不銹鋼分析色譜柱（4.6×250mm，5μm）。

1.2 試藥：鬼臼毒素對(duì)照品（Sigma公司，含量98.8%）,疣克酊劑（自制，批號(hào)：010508，010509，010510）。甲醇為色譜級(jí)，其它化學(xué)試劑均為分析純。

2.方法與結(jié)果

        圖1  疣克酊酊劑的HPLC色譜圖（鬼臼毒素的tR =21.160min）

2.2 線性關(guān)系考察  精密稱取鬼臼毒素對(duì)照品49.6mg，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取0.5，0.75，1，1.5，2mL置10mL量瓶中，以流動(dòng)相稀釋成濃度為24.8、37.2、49.6、74.4和99.2 μg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣50μL供HPLC分析，記錄色譜峰面積。以鬼臼毒素的濃度（C）對(duì)其峰面積（A）做回歸，得回歸方程為C=2.779×10-+0.236（r=0.9999，n=6），結(jié)果表明鬼臼毒素在24.8~99.2 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)  制備低、中、高三個(gè)不同濃度的鬼臼毒素（24.8、49.6、99.2μg·mL-1）樣品，于同一日內(nèi)和6日內(nèi)分別測定含量各6次，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果日內(nèi)RSD分別為0.90，0.82，0.65%，日間RSD分別為1.03，0.88，0.76%。

2.4 回收率試驗(yàn)  精密量取已知含量的鬼臼毒素樣品適量，分別精密加入低、中、高三個(gè)不同量的鬼臼毒素對(duì)照液，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，分別測定含量各6次，以實(shí)測值與理論值之比計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表1。

            表1  鬼臼毒素分析方法回收率試驗(yàn)（n=6，`x±s）

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)  取同一批號(hào)樣品，按樣品測定項(xiàng)下方法測定5次，其RSD結(jié)果為1.02%。

2.6 樣品的含量測定  鬼臼毒素對(duì)照品溶液制備：精密稱取鬼臼毒素對(duì)照品5mg，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為50μg·mL-1對(duì)照品溶液。供試品溶液制備：精密量取疣克酊酊劑1mL，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各50μL，注入液相色譜儀，按前述色譜條件，以峰面積按外標(biāo)法測定含量。3批自制樣品測定結(jié)果見表2。

                   表2  制劑中鬼臼毒素含量測定結(jié)果（n=3）

3.討論

3.1檢測波長的選擇  用二極管陣列檢測器分析比較了鬼臼毒素對(duì)照品及樣品溶液在190~380nm間的紫外吸收光譜，結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，鬼臼毒素在285nm處有zui大吸收峰，故選擇285nm為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相及色譜柱的確定  本實(shí)驗(yàn)考察了不同色譜柱及不同甲醇含量（10%~80%）下，鬼臼毒素與雜質(zhì)間的分離度。結(jié)果表明，選用Hypersil C18（4.6×150mm，5μm）柱，鬼臼毒素與雜質(zhì)間不能*分離，選擇Discovery C18（4.6×250mm，5μm）柱，可達(dá)*基線分離。同時(shí)甲醇比例的增減也直接影響著制劑中樣品的分離度，隨著甲醇比例的減少，鬼臼毒素與雜質(zhì)間分離度逐漸增大，但分離時(shí)間也相應(yīng)延長。當(dāng)甲醇含量為50%時(shí)即可達(dá)*分離，此時(shí)鬼臼毒素保留時(shí)間相對(duì)較短，分析時(shí)間可控制在25min以內(nèi)。

3.3 文獻(xiàn)報(bào)道的方法中，樣品的預(yù)處理過程較為復(fù)雜，導(dǎo)致操作中的誤差較大，而且靈敏度較低。本文采用RP-HPLC法測定鬼臼毒素含量，其操作準(zhǔn)確簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，有利于藥品質(zhì)量的控制，確保藥物的臨床療效。

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